Extracción en fase sólida: propósito y casos de uso
La extracción en fase sólida (SPE) es una técnica de preparación de muestras que se utiliza para aislar, limpiar o concentrar analitos antes del análisis instrumental. Un cartucho de extracción en fase sólida contiene un lecho de sorbente empacado entre fritas. Cuando una muestra líquida pasa a través del lecho, los analitos se reparten entre la fase líquida y el sorbente. Los analitos retenidos se lavan y se eluyen después en un volumen menor de disolvente.
La SPE se utiliza cuando la matriz de la muestra es demasiado compleja para inyección directa, cuando los analitos están presentes a niveles de trazas o cuando el disolvente de la muestra es incompatible con el sistema analítico. Es habitual antes de LC-MS, GC-MS, HPLC, UV-Vis y otras separaciones. Los objetivos típicos incluyen:
- Limpieza: eliminar componentes de la matriz que causan supresión iónica, ensuciamiento de la columna o interferencia de línea base.
- Concentración: transferir analitos de una muestra acuosa grande a un volumen de elución orgánico pequeño.
- Cambio de matriz: pasar analitos de una matriz acuosa o no polar a un disolvente compatible con el siguiente paso.
- Fraccionamiento: separar analitos de interferencias estructuralmente relacionadas controlando la retención.
La SPE no siempre es el mejor primer paso. Para muestras con alta carga de partículas, contenido de proteínas o grasa, puede ser necesaria una filtración, precipitación o extracción tipo QuEChERS preliminar antes de cargar los cartuchos SPE.
Tipos de sorbente: C18, HLB y sílice
La química del sorbente determina la retención. Las tres fases SPE más comunes son C18, HLB y sílice. Cada una es adecuada para un intervalo de polaridad y un tipo de matriz diferentes.
Cartuchos SPE C18
C18 es un sorbente de sílice con octadecilo enlazado. Opera por retención en fase inversa: los analitos no polares y moderadamente no polares se retienen de muestras acuosas o polares. Un cartucho SPE C18 se selecciona a menudo para plaguicidas, PAH, esteroides, fármacos y otros compuestos hidrófobos.
Guía de método para C18:
- Acondicionar con metanol, acetonitrilo u otro disolvente orgánico miscible en agua.
- Equilibrar con agua o un tampón acuoso.
- Cargar en un disolvente de muestra con bajo contenido orgánico.
- Lavar con agua o una solución orgánica débil.
- Eluir con metanol, acetonitrilo o un disolvente orgánico más fuerte.
Los cartuchos C18 son menos adecuados para analitos muy polares, a menos que se utilice apareamiento iónico u otro mecanismo de retención. El control del pH puede mejorar la retención de compuestos ionizables, pero el intervalo de pH utilizable depende de la fase enlazada y debe confirmarse para el método específico.
Cartucho HLB
Un cartucho HLB contiene un polímero equilibrado hidrofílico-lipofílico. Es un sorbente de fase inversa humectable en agua que retiene analitos tanto polares como no polares. Esto hace que un cartucho HLB sea útil durante el desarrollo de métodos cuando se desconoce la polaridad del analito o cuando un método debe cubrir una amplia gama de compuestos.
HLB se usa comúnmente para:
- Metabolitos polares y productos de degradación.
- Fármacos y productos de cuidado personal en agua.
- Plaguicidas con un amplio intervalo de polaridad.
- Extractos de alimentos y ambientales con interferencias mixtas.
Protocolo típico de HLB:
- Acondicionar con metanol o acetonitrilo.
- Equilibrar con agua o tampón.
- Cargar una muestra acuosa o con bajo contenido orgánico.
- Lavar con agua, tampón o una solución débil de metanol.
- Eluir con metanol, acetonitrilo o metanol que contenga ácido o base según sea necesario.
Los sorbentes poliméricos HLB son generalmente estables en un amplio intervalo de pH, pero el intervalo de trabajo exacto debe confirmarse con el proveedor para el producto y método específicos.
Cartuchos SPE de sílice
La sílice sin enlazar es un sorbente polar que se usa en SPE de fase normal. Retiene analitos polares de matrices no polares. La sílice se usa a menudo para lípidos, aceites, esteroides, vitaminas y compuestos polares extraídos de hexano, diclorometano u otros disolventes no polares.
Protocolo típico de sílice:
- Acondicionar con un disolvente no polar como hexano o diclorometano.
- Cargar la muestra en un disolvente no polar.
- Lavar con disolvente no polar para eliminar interferencias no polares.
- Eluir con un disolvente más polar como metanol, acetato de etilo o diclorometano/metanol.
Por lo general, la sílice debe mantenerse alejada del agua, a menos que el método utilice específicamente sílice desactivada o un modo de fase normal acuosa. Los grupos silanol activos también pueden causar adsorción irreversible de analitos muy polares.
Comparación de sorbentes
| Sorbente | Mecanismo de retención | Polaridad del analito | Disolvente de carga típico | Disolvente de elución típico | Notas |
|---|---|---|---|---|---|
| **C18** | Fase inversa | No polar a moderadamente polar | Agua, tampón, bajo contenido orgánico | Metanol, acetonitrilo, diclorometano | No ideal para analitos muy polares; mantener el lecho húmedo |
| **HLB** | Polímero de fase inversa | Amplia: polar y no polar | Agua, tampón, bajo contenido orgánico | Metanol, acetonitrilo | Humectable en agua; útil para polaridad desconocida |
| **Sílice** | Fase normal | Polar | Hexano, diclorometano, no polar | Metanol, acetato de etilo, disolvente polar | Evitar cargas acuosas a menos que el método lo especifique |
Selección de masa de lecho y volumen del cartucho
La masa de lecho y el volumen del cartucho controlan la capacidad, la recuperación y el volumen de elución. Seleccione el lecho más pequeño que retenga el analito sin ruptura. Un lecho más grande puede manejar más matriz, pero generalmente requiere más disolvente de acondicionamiento, lavado y elución.
Los siguientes son puntos de partida generales para el desarrollo de métodos, no especificaciones de producto fijas.
| Volumen de muestra | Complejidad de la matriz | Masa de lecho típica | Volumen de cartucho típico | Notas |
|---|---|---|---|---|
| <1 mL | Limpia | 30–50 mg | 1 mL | Buena para alta concentración de analito |
| 1–10 mL | Moderada | 50–100 mg | 1–3 mL | Intervalo común para bioanálisis y extractos de alimentos |
| 10–100 mL | Moderada a sucia | 100–500 mg | 3–6 mL | Común para agua ambiental |
| >100 mL | Acuosa diluida | 500 mg–1 g | 6–12 mL | Enriquecimiento de trazas; vigilar la ruptura |
| Variable | Sucia | 200–500 mg | 3–6 mL | Pre-limpiar si es posible; la capacidad se consume por la matriz |
Reglas de selección:
- La capacidad se basa en la masa. Una muestra sucia puede agotar el sorbente incluso cuando la masa de analito es baja.
- Haga coincidir el volumen del cartucho con los volúmenes de disolvente. El depósito o cartucho debe contener las soluciones de acondicionamiento, carga, lavado y elución.
- Use un lecho más grande para matrices sucias. Si la recuperación disminuye cuando aumenta el volumen de muestra, es probable que haya ruptura.
- Use un lecho más pequeño para alta recuperación. Los lechos más pequeños requieren menos disolvente de elución y reducen el tiempo de evaporación.
- Controle el caudal. El flujo por gravedad o vacío bajo, a menudo alrededor de 1–2 mL/min, mejora las interacciones reproducibles. Un caudal alto puede reducir la retención.
- No deje que el sorbente se seque durante el acondicionamiento y la carga en fase inversa, a menos que el método lo requiera.
Protocolo de cuatro pasos: acondicionar, cargar, lavar, eluir
Acondicionar
El acondicionamiento humedece el sorbente y crea una superficie reproducible para la retención.
- Fase inversa C18 y HLB: pasar metanol o acetonitrilo, luego agua o tampón.
- Sílice de fase normal: pasar un disolvente no polar como hexano o diclorometano.
- Use volumen suficiente para humedecer todo el lecho. No permita que el lecho se seque antes de la carga.
Cargar
La carga introduce la muestra.
- Disuelva o diluya la muestra en un disolvente lo suficientemente débil para promover la retención.
- Filtre o centrifugue las partículas antes de cargar.
- Flujo a caudal controlado. Una carga rápida puede reducir el tiempo de contacto y causar ruptura.
- No exceda la capacidad del sorbente. Si la muestra está concentrada o sucia, use un lecho más grande o diluya la carga.
Lavar
El lavado elimina las interferencias mientras retiene el analito.
- Use un disolvente lo suficientemente fuerte para eliminar componentes de la matriz pero lo suficientemente débil para mantener el analito en el sorbente.
- Vigile la ruptura del analito si se aumenta el volumen o la fuerza del lavado.
- Para métodos de modo mixto o intercambio iónico, el pH y la fuerza iónica del lavado son críticos. Para C18, HLB y sílice simples, el contenido orgánico es el control principal.
Eluir
La elución recupera el analito retenido.
- Use un disolvente que interrumpa el mecanismo de retención.
- Para C18 y HLB, el metanol, acetonitrilo o un disolvente orgánico fuerte son típicos.
- Para sílice, un disolvente polar como metanol o acetato de etilo es típico.
- Recoja el volumen más pequeño que proporcione recuperación cuantitativa.
- Evapore y reconstituya solo si el disolvente de elución es incompatible con el instrumento analítico. Use un disolvente de retención para analitos volátiles.
Lista de verificación práctica
- [ ] Confirmar que la química del sorbente coincida con la polaridad del analito.
- [ ] Acondicionar el lecho y mantenerlo húmedo.
- [ ] Ajustar el pH de la muestra si el analito es ionizable.
- [ ] Prefiltrar o pre-limpiar muestras sucias.
- [ ] Determinar el volumen de ruptura con una muestra fortificada.
- [ ] Usar un estándar interno cuando sea posible.
- [ ] Optimizar la fuerza del lavado para eliminar interferencias sin perder analito.
- [ ] Validar la recuperación en la matriz real.
- [ ] Evitar el secado excesivo durante la evaporación.
- [ ] Reconstituir en un disolvente compatible con el siguiente paso analítico.
Aplicaciones: ambiental, alimentaria y farmacéutica
Ambiental
La SPE se usa para extractos de agua, suelo, sedimento y lodos. Los analitos típicos incluyen plaguicidas, PAH, PCB, fármacos, hormonas y productos químicos industriales. Las muestras de agua de gran volumen a menudo requieren C18 o HLB para el enriquecimiento de trazas. HLB es útil cuando los analitos abarcan un amplio intervalo de polaridad. La filtración y el ajuste de pH son comunes antes de la carga.
Alimentos y bebidas
Los extractos de alimentos contienen grasas, pigmentos, azúcares, ácidos orgánicos y proteínas que pueden interferir con LC-MS o GC-MS. La limpieza por SPE se usa para residuos de plaguicidas, micotoxinas, fármacos veterinarios, aditivos y compuestos aromáticos. C18 es adecuado para analitos no polares; HLB es útil para una cobertura amplia de polaridad; la sílice se usa a menudo para la eliminación de lípidos y aceites de extractos no polares.
Farmacéutica y clínica
Las muestras de plasma, suero, orina y tejido requieren limpieza antes del análisis. La precipitación de proteínas a menudo se realiza primero, seguida de SPE. HLB es útil para una amplia gama de fármacos y metabolitos. C18 se selecciona para compuestos no polares. La sílice se puede usar para la limpieza en fase normal de extractos. La validación del método, la recuperación y las pruebas de efecto matriz son requisitos estándar en entornos regulados.
Solución de problemas de baja recuperación
| Síntoma | Causa probable | Acción correctiva |
|---|---|---|
| El analito aparece en la carga o el lavado | Ruptura o lavado demasiado fuerte | Aumentar la masa de lecho, diluir la muestra, reducir el orgánico en carga/lavado, ralentizar el flujo |
| Baja recuperación en la elución | Disolvente de elución demasiado débil | Aumentar la fuerza orgánica o cambiar el disolvente; probar metanol, acetonitrilo o modificador ácido/base |
| El analito no se retiene | Química de sorbente o pH incorrectos | Ajustar el sorbente a la polaridad; ajustar el pH para favorecer la retención; considerar HLB para analitos polares |
| Mala reproducibilidad | Sorbente seco, flujo inconsistente o vacío variable | Mantener el lecho húmedo, controlar el flujo, usar un colector de vacío con válvulas individuales |
| Persiste la interferencia de la matriz | Lavado demasiado débil o sorbente sobrecargado | Optimizar el lavado, reducir la carga de muestra, usar un sorbente más selectivo, pre-limpiar la muestra |
| Pérdida durante la evaporación | Volatilidad del analito o secado excesivo | Reducir la temperatura de evaporación, agregar disolvente de retención, detener antes de la sequedad completa |
| Analito muy polar no retenido en C18 | Retención en fase inversa demasiado débil | Usar HLB, apareamiento iónico u otro mecanismo de retención |
Resumen de especificaciones y selección
| Parámetro | C18 | HLB | Sílice |
|---|---|---|---|
| Modo de retención | Fase inversa | Polímero de fase inversa | Fase normal |
| Retención principal | Interacciones no polares | Interacciones hidrofílicas y lipofílicas | Interacciones polares |
| Mejor para | Analitos no polares a moderadamente polares | Analitos polares y no polares | Analitos polares de matrices no polares |
| Elución típica | Metanol, acetonitrilo | Metanol, acetonitrilo | Metanol, acetato de etilo |
| Carga acuosa | Sí | Sí | Generalmente no |
| Consideraciones de pH | Verificar el intervalo de la fase enlazada | Generalmente amplio; confirmar con el proveedor | Evitar acuoso a menos que el método lo especifique |
| Aplicaciones comunes | Plaguicidas, PAH, esteroides, fármacos | Metabolitos, contaminantes polares, métodos de amplio alcance | Lípidos, aceites, esteroides, vitaminas |
ALWSCI Technologies suministra cartuchos SPE en sorbentes C18, HLB y sílice. Para formato, masa de lecho y opciones de empaque, Envíe su hoja de especificaciones. Las dimensiones de personalización incluyen tamaño, material, color, logotipo, código de barras, empaque, molde, silanización y tratamiento Ultra-Clean. El plazo de entrega de existencias es de 2–5 días; el plazo de entrega de producción es de 15–25 días; el plazo de entrega ODM/OEM es de 30–90 días. El MOQ no tiene requisito estricto, aunque se recomiendan pedidos al exterior de ≥1,000 pcs. Se invita a agentes y distribuidores a contactar el departamento de negocios internacionales.
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