Extraction en phase solide : objectif et cas d'usage
L'extraction en phase solide (SPE) est une technique de préparation d'échantillons utilisée pour isoler, purifier ou concentrer les analytes avant l'analyse instrumentale. Une cartouche d'extraction en phase solide contient un lit de sorbant maintenu entre des frittés. Lorsqu'un échantillon liquide traverse le lit, les analytes se partagent entre la phase liquide et le sorbant. Les analytes retenus sont ensuite lavés et élués dans un plus petit volume de solvant.
La SPE est utilisée lorsque la matrice de l'échantillon est trop complexe pour une injection directe, lorsque les analytes sont présents à l'état de traces ou lorsque le solvant de l'échantillon est incompatible avec le système analytique. Elle est courante avant LC-MS, GC-MS, HPLC, UV-Vis et autres séparations. Les objectifs typiques incluent :
- Purification : éliminer les composants de la matrice qui provoquent une suppression ionique, un encrassement de colonne ou une interférence de ligne de base.
- Concentration : transférer les analytes d'un grand échantillon aqueux vers un petit volume d'élution organique.
- Échange de matrice : faire passer les analytes d'une matrice aqueuse ou non polaire vers un solvant compatible avec l'étape suivante.
- Fractionnement : séparer les analytes des interférences structurellement apparentées en contrôlant la rétention.
La SPE n'est pas toujours la meilleure première étape. Pour les échantillons à forte charge particulaire, teneur en protéines ou en graisses, une filtration préliminaire, une précipitation ou une extraction de type QuEChERS peut être nécessaire avant le chargement des cartouches SPE.
Types de sorbants : C18, HLB et silice
La chimie du sorbant détermine la rétention. Les trois phases SPE les plus courantes sont C18, HLB et silice. Chacune convient à une plage de polarité et un type de matrice différents.
Cartouches SPE C18
C18 est un sorbant de silice greffée à l'octadécyle. Il fonctionne par rétention en phase inverse : les analytes non polaires et modérément non polaires sont retenus à partir d'échantillons aqueux ou polaires. Une cartouche SPE C18 est souvent choisie pour les pesticides, les HAP, les stéroïdes, les produits pharmaceutiques et autres composés hydrophobes.
Recommandations de méthode pour C18 :
- Conditionner avec du méthanol, de l'acétonitrile ou un autre solvant organique miscible à l'eau.
- Équilibrer avec de l'eau ou un tampon aqueux.
- Charger dans un solvant d'échantillon à faible teneur organique.
- Laver avec de l'eau ou une solution organique faible.
- Éluer avec du méthanol, de l'acétonitrile ou un solvant organique plus fort.
Les cartouches C18 conviennent moins aux analytes très polaires, sauf si un appariement d'ions ou un autre mécanisme de rétention est utilisé. Le contrôle du pH peut améliorer la rétention des composés ionisables, mais la plage de pH utilisable dépend de la phase greffée et doit être confirmée pour la méthode spécifique.
Cartouche HLB
Une cartouche HLB contient un polymère équilibré hydrophile-lipophile. C'est un sorbant en phase inverse mouillable à l'eau qui retient à la fois les analytes polaires et non polaires. Cela rend une cartouche HLB utile lors du développement de méthode lorsque la polarité de l'analyte est inconnue ou lorsqu'une méthode doit couvrir une large gamme de composés.
HLB est couramment utilisée pour :
- Les métabolites polaires et les produits de dégradation.
- Les produits pharmaceutiques et de soins personnels dans l'eau.
- Les pesticides à large plage de polarité.
- Les extraits alimentaires et environnementaux à interférences mixtes.
Protocole HLB typique :
- Conditionner avec du méthanol ou de l'acétonitrile.
- Équilibrer avec de l'eau ou un tampon.
- Charger un échantillon aqueux ou à faible teneur organique.
- Laver avec de l'eau, un tampon ou une solution de méthanol faible.
- Éluer avec du méthanol, de l'acétonitrile ou du méthanol contenant un acide ou une base selon les besoins.
Les sorbants polymères HLB sont généralement stables sur une large plage de pH, mais la plage de travail exacte doit être confirmée auprès du fournisseur pour le produit et la méthode spécifiques.
Cartouches SPE silice
La silice non greffée est un sorbant polaire utilisé en SPE en phase normale. Elle retient les analytes polaires à partir de matrices non polaires. La silice est souvent utilisée pour les lipides, les huiles, les stéroïdes, les vitamines et les composés polaires extraits de l'hexane, du dichlorométhane ou d'autres solvants non polaires.
Protocole silice typique :
- Conditionner avec un solvant non polaire tel que l'hexane ou le dichlorométhane.
- Charger l'échantillon dans un solvant non polaire.
- Laver avec un solvant non polaire pour éliminer les interférences non polaires.
- Éluer avec un solvant plus polaire tel que le méthanol, l'acétate d'éthyle ou le dichlorométhane/méthanol.
La silice doit généralement être tenue à l'écart de l'eau, sauf si la méthode utilise spécifiquement une silice désactivée ou un mode phase normale aqueux. Les groupes silanol actifs peuvent également provoquer une adsorption irréversible des analytes très polaires.
Comparaison des sorbants
| Sorbant | Mécanisme de rétention | Polarité de l'analyte | Solvant de chargement typique | Solvant d'élution typique | Remarques |
|---|---|---|---|---|---|
| **C18** | Phase inverse | Non polaire à modérément polaire | Eau, tampon, faible teneur organique | Méthanol, acétonitrile, dichlorométhane | Idéal pour les analytes très polaires ; garder le lit mouillé |
| **HLB** | Polymère en phase inverse | Large : polaire et non polaire | Eau, tampon, faible teneur organique | Méthanol, acétonitrile | Mouillable à l'eau ; utile pour polarité inconnue |
| **Silice** | Phase normale | Polaire | Hexane, dichlorométhane, non polaire | Méthanol, acétate d'éthyle, solvant polaire | Éviter les chargements aqueux sauf si la méthode le spécifie |
Sélection de la masse de lit et du volume de cartouche
La masse de lit et le volume de cartouche contrôlent la capacité, la récupération et le volume d'élution. Sélectionnez le plus petit lit qui retient l'analyte sans percée. Un lit plus grand peut traiter plus de matrice, mais nécessite généralement plus de solvant de conditionnement, de lavage et d'élution.
Les valeurs suivantes sont des points de départ généraux pour le développement de méthode, et non des spécifications produit fixes.
| Volume d'échantillon | Complexité de la matrice | Masse de lit typique | Volume de cartouche typique | Remarques |
|---|---|---|---|---|
| <1 mL | Propre | 30–50 mg | 1 mL | Bon pour une forte concentration d'analyte |
| 1–10 mL | Modérée | 50–100 mg | 1–3 mL | Plage courante pour la bioanalyse et les extraits alimentaires |
| 10–100 mL | Modérée à sale | 100–500 mg | 3–6 mL | Courant pour l'eau environnementale |
| >100 mL | Aqueux dilué | 500 mg–1 g | 6–12 mL | Enrichissement de traces ; surveiller la percée |
| Variable | Sale | 200–500 mg | 3–6 mL | Pré-nettoyer si possible ; la capacité est consommée par la matrice |
Règles de sélection :
- La capacité est basée sur la masse. Un échantillon sale peut épuiser le sorbant même lorsque la masse d'analyte est faible.
- Faites correspondre le volume de cartouche aux volumes de solvant. Le réservoir ou la cartouche doit contenir les solutions de conditionnement, de chargement, de lavage et d'élution.
- Utilisez un lit plus grand pour les matrices sales. Si la récupération chute lorsque le volume d'échantillon augmente, une percée est probable.
- Utilisez un lit plus petit pour une récupération élevée. Les lits plus petits nécessitent moins de solvant d'élution et réduisent le temps d'évaporation.
- Contrôlez le débit. Un débit par gravité ou sous faible vide, souvent autour de 1–2 mL/min, améliore la reproductibilité des interactions. Un débit élevé peut réduire la rétention.
- Ne laissez pas le sorbant sécher pendant le conditionnement et le chargement en phase inverse, sauf si la méthode l'exige.
Protocole en quatre étapes : conditionner, charger, laver, éluer
Conditionner
Le conditionnement mouille le sorbant et crée une surface reproductible pour la rétention.
- Phase inverse C18 et HLB : faire passer du méthanol ou de l'acétonitrile, puis de l'eau ou un tampon.
- Silice en phase normale : faire passer un solvant non polaire tel que l'hexane ou le dichlorométhane.
- Utilisez un volume suffisant pour mouiller tout le lit. Ne laissez pas le lit sécher avant le chargement.
Charger
Le chargement introduit l'échantillon.
- Dissolvez ou diluez l'échantillon dans un solvant suffisamment faible pour favoriser la rétention.
- Filtrez ou centrifugez les particules avant le chargement.
- Faites circuler à un débit contrôlé. Un chargement rapide peut réduire le temps de contact et provoquer une percée.
- Ne dépassez pas la capacité du sorbant. Si l'échantillon est concentré ou sale, utilisez un lit plus grand ou diluez le chargement.
Laver
Le lavage élimine les interférences tout en retenant l'analyte.
- Utilisez un solvant suffisamment fort pour éliminer les composants de la matrice mais suffisamment faible pour garder l'analyte sur le sorbant.
- Surveillez la percée de l'analyte si le volume ou la force du lavage est augmenté.
- Pour les méthodes en mode mixte ou échange d'ions, le pH et la force ionique du lavage sont critiques. Pour C18, HLB et silice simples, la teneur organique est le principal paramètre de contrôle.
Éluer
L'élution récupère l'analyte retenu.
- Utilisez un solvant qui perturbe le mécanisme de rétention.
- Pour C18 et HLB, le méthanol, l'acétonitrile ou un solvant organique fort sont typiques.
- Pour la silice, un solvant polaire tel que le méthanol ou l'acétate d'éthyle est typique.
- Collectez le plus petit volume qui fournit une récupération quantitative.
- Évaporez et reconstituez uniquement si le solvant d'élution est incompatible avec l'instrument analytique. Utilisez un solvant de garde pour les analytes volatils.
Liste de contrôle pratique
- [ ] Confirmer que la chimie du sorbant correspond à la polarité de l'analyte.
- [ ] Conditionner le lit et le garder mouillé.
- [ ] Ajuster le pH de l'échantillon si l'analyte est ionisable.
- [ ] Pré-filtrer ou pré-nettoyer les échantillons sales.
- [ ] Déterminer le volume de percée avec un échantillon enrichi.
- [ ] Utiliser un étalon interne lorsque c'est possible.
- [ ] Optimiser la force du lavage pour éliminer les interférences sans perdre l'analyte.
- [ ] Valider la récupération dans la matrice réelle.
- [ ] Éviter le sur-séchage pendant l'évaporation.
- [ ] Reconstituez dans un solvant compatible avec l'étape analytique suivante.
Applications : environnementales, alimentaires et pharmaceutiques
Environnement
La SPE est utilisée pour l'eau, le sol, les sédiments et les extraits de boues. Les analytes typiques incluent les pesticides, les HAP, les PCB, les produits pharmaceutiques, les hormones et les produits chimiques industriels. Les grands volumes d'échantillons d'eau nécessitent souvent C18 ou HLB pour l'enrichissement de traces. HLB est utile lorsque les analytes couvrent une large plage de polarité. La filtration et l'ajustement du pH sont courants avant le chargement.
Alimentation et boissons
Les extraits alimentaires contiennent des graisses, des pigments, des sucres, des acides organiques et des protéines qui peuvent interférer avec la LC-MS ou la GC-MS. La purification par SPE est utilisée pour les résidus de pesticides, les mycotoxines, les médicaments vétérinaires, les additifs et les composés aromatiques. C18 convient aux analytes non polaires ; HLB est utile pour une large couverture de polarité ; la silice est souvent utilisée pour l'élimination des lipides et des huiles des extraits non polaires.
Pharmaceutique et clinique
Les échantillons de plasma, sérum, urine et tissus nécessitent une purification avant analyse. La précipitation des protéines est souvent réalisée en premier, suivie de la SPE. HLB est utile pour une large gamme de médicaments et de métabolites. C18 est sélectionné pour les composés non polaires. La silice peut être utilisée pour la purification en phase normale des extraits. La validation de méthode, la récupération et les tests d'effet de matrice sont des exigences standard dans les environnements réglementés.
Dépannage : faible récupération
| Symptôme | Cause probable | Action corrective |
|---|---|---|
| L'analyte apparaît dans le chargement ou le lavage | Percée ou lavage trop fort | Augmenter la masse de lit, diluer l'échantillon, réduire la teneur organique dans le chargement/lavage, ralentir le débit |
| Faible récupération à l'élution | Solvant d'élution trop faible | Augmenter la force organique ou changer de solvant ; tester le méthanol, l'acétonitrile ou un modificateur acide/base |
| Analyte non retenu | Chimie de sorbant ou pH incorrect | Faire correspondre le sorbant à la polarité ; ajuster le pH pour favoriser la rétention ; envisager HLB pour les analytes polaires |
| Reproductibilité médiocre | Sorbant séché, débit incohérent ou vide variable | Garder le lit mouillé, contrôler le débit, utiliser un manifold à vide avec vannes individuelles |
| Interférence de matrice persistante | Lavage trop faible ou sorbant surchargé | Optimiser le lavage, réduire la charge d'échantillon, utiliser un sorbant plus sélectif, pré-nettoyer l'échantillon |
| Perte pendant l'évaporation | Volatilité de l'analyte ou sur-séchage | Baisser la température d'évaporation, ajouter un solvant de garde, arrêter avant siccité complète |
| Analyte très polaire non retenu sur C18 | Rétention en phase inverse trop faible | Utiliser HLB, l'appariement d'ions ou un autre mécanisme de rétention |
Résumé des spécifications et de la sélection
| Paramètre | C18 | HLB | Silice |
|---|---|---|---|
| Mode de rétention | Phase inverse | Polymère en phase inverse | Phase normale |
| Rétention principale | Interactions non polaires | Interactions hydrophiles et lipophiles | Interactions polaires |
| Idéal pour | Analytes non polaires à modérément polaires | Analytes polaires et non polaires | Analytes polaires de matrices non polaires |
| Élution typique | Méthanol, acétonitrile | Méthanol, acétonitrile | Méthanol, acétate d'éthyle |
| Chargement aqueux | Oui | Oui | Généralement non |
| Considérations de pH | Vérifier la plage de la phase greffée | Généralement large ; confirmer avec le fournisseur | Éviter l'aquex sauf si la méthode le spécifie |
| Applications courantes | Pesticides, HAP, stéroïdes, médicaments | Métabolites, polluants polaires, méthodes à large spectre | Lipides, huiles, stéroïdes, vitamines |
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